Пцр диагностика — что это, задачи, принцип использования

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

Процесс

ПЦР представляет собой простой, но элегантный, ферментативный анализ, который позволяет амплифицировать (увеличивать количество копий) специфический фрагмент ДНК из смеси из множества молекул нуклеиновых кислот.

Доктор Муллис (Mullis), открывший ПЦР, заявил, что «метод позволяет вам выбрать фрагмент ДНК, который вам интересен, и сделать столько копий, сколько вам нужно» (Mullis, 1990). ПЦР можно проводить с использованием исходной ДНК из различных тканей и организмов, включая периферическую кровь, кожу, волосы, слюну и микроорганизмы.

Для ПЦР необходимы только следовые количества ДНК, чтобы генерировать достаточное количество копий для анализа с использованием обычных лабораторных методов. По этой причине ПЦР является очень чувствительным анализом.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияПринципиальная схема полимеразной цепной реакции

Каждый ПЦР-анализ требует наличия матричной ДНК, праймеров, нуклеотидов и ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза является ключевым ферментом, который связывает отдельные нуклеотиды вместе с образованием конечного продукта реакции. Нуклеотиды включают четыре основания — аденин, тимин, цитозин и гуанин (A, T, C, G).

Они действуют как строительные блоки, которые используются ДНК-полимеразой для создания результирующего продукта. Праймеры в реакции указывают на ДНК-продукт, подлежащий амплификации. Они представляют собой короткие фрагменты ДНК с определенной последовательностью, комплементарной ДНК-мишени, которая должна быть обнаружена и амплифицирована.

Они служат точкой расширения ДНК-полимеразы.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияАмплификатор Invitrogen Verity

Вышеупомянутые компоненты смешивают в пробирке или 96-луночном планшете, а затем помещают в амплификатор (или термоциклер), что позволяет проводить повторяющиеся циклы амплификации ДНК на трех основных этапах. Прибор имеет тепловой блок с отверстиями, в которые вставлены пробирки или планшеты, содержащие реакционную смесь.

Амплификатор поднимает и понижает температуру блока на дискретных, точных и запрограммированных этапах. Реакционный раствор сначала нагревают выше точки плавления двух комплементарных нитей ДНК-мишени, что позволяет разделить двухцепочечную молекулу на отдельные нити, процесс, называемый денатурацией.

Затем температуру снижают, чтобы позволить праймерам связаться с целевыми фрагментами ДНК, процесс, известный как гибридизация или отжиг. Отжиг между праймерами и ДНК-мишенью происходит только в том случае, если они комплементарны в последовательности.

Температура снова повышается, и в это время ДНК-полимераза способна расширять праймеры путем добавления нуклеотидов к развивающейся нити ДНК. При каждом повторении этих трех шагов число копируемых молекул ДНК удваивается.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияЗаказать амплификатор, а также получить консультацию специалистов по подбору оборудования и расходных материалов вы можете на сайте компании Пущинские лаборатории www.laboratorii.com

Применение в медицине

В клинической диагностике метод ПЦР получил очень широкое распространение благодаря своей высокой чувствительности а также относительно небольшому (от 20 до 60 минут) времени проведения анализа. Используется он в областях, перечисленных ниже:

  • Онкология.
  • Урология.
  • Гематология.
  • Гастроэнтерология.
  • Пульмонология.
  • Физиатрия и прочие медицинские разделы.

С помощью ПЦР определяют такие заболевания, как гепатиты C и B, ВИЧ, СПИД, хламидиоз и многие другие. Проводится анализ методом полимеразной цепной реакции на образцах крови.

Анализ продукта ПЦР

Существует два основных способа визуализации продуктов ПЦР

  • окрашивание амплифицированного ДНК-продукта химическим красителем, таким как бромид этидия, который интеркалирует между двумя нитями дуплекса или
  • помечая ПЦР-праймеры или нуклеотиды флуоресцентными красителями (флуорофорами) до амплификации.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияЭлектрофорез в агарозном геле (Источник wikipedia.org)

Последний метод позволяет непосредственно помещать эти метки в продукт ПЦР. Наиболее широко используемым методом анализа продукта является использование электрофореза в агарозном геле, который разделяет продукты ДНК по размерам и заряду. Данный вид электрофореза является самым простым методом визуализации и анализа результатов ПЦР, который позволят определить наличие мишени.

Полимеразная цепная реакция, используемая для обнаружения конкретной цепи ДНК, называется качественной. Качественная ПЦР является хорошей методикой получения ДНК для клонирования или идентификации патогенна.

Количественная ПЦР

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияReal-time амплификатор QuantStudio

Количественные данные в реальном времени (qRT-PCR, реал-тайм ПЦР) позволяющие получить дополнительную информацию помимо простого обнаружения определенной последовательности. Реал-тайм ПЦР указывает, какая часть конкретной ДНК или гена присутствует в образце. qRT-PCR позволяет одновременно обнаруживать и количественно определять продукт ПЦР в режиме реального времени, в то время как он синтезируется. Два распространенных метода, используемых для обнаружения и количественного определения продукта, включают  флуоресцентные красители, которые неспецифически интеркалируют с двухцепочечной ДНК и последовательно-специфичные ДНК-зонды, состоящие из флуоресцентно меченных последовательностей. Флуоресценция возникает только после гибридизации зонда с его комплементарной ДНК-мишенью. ПЦР в реальном времени можно комбинировать с обратной транскрипцией, которая позволяет превращать РНК в кДНК (обратная транскрипция), после чего количественную оценку кДНК выполняют с помощью qPCR. Количественное определение желаемого гена во время экспоненциальной амплификации позволяет избежать проблем, связанных с конечной точкой ПЦР, которая анализируется после завершения окончательного цикла ПЦР.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использованияМикропробирки для ПЦР

Анализ опухолей является идеальным примером использования ПЦР. Ее можно использовать для выделения и амплификации ДНК генов-супрессоров опухолей или протоонкогенов.

В свою очередь, количественная ПЦР может быть использована для количественного определения  выделенного конкретного гена.

С другой стороны, количественная ПЦР может быть использована для анализа отдельных клеток и количественной оценки любой комбинации ДНК, мРНК и белков.

Преимущества и ограничения ПЦР

Для ПЦР существует несколько преимуществ. Во-первых, это простой для понимания метод, который быстро дает результаты и использования.

Во-вторых, это высокочувствительный метод, способный производить огромное количество копий определенного продукта для секвенирования, клонирования и анализа.

Это справедливо и для количественной реал-тайм ПЦР, но она имеет преимущество количественного определения синтезируемого продукта. Таким образом, его можно использовать для анализа изменений уровней экспрессии генов в опухолях, микробах или других болезненных состояниях.

Хотя ПЦР является ценным методом, у нее есть ограничения. Поскольку она является высокочувствительной методикой, любая форма загрязнения (контаминации) образца даже следовыми количествами ДНК может приводить к ошибочным результатам. Кроме того, для разработки праймеров необходимы некоторые данные предварительной последовательности.

Поэтому ПЦР можно использовать только для идентификации присутствия или отсутствия известного патогена или гена. Другое ограничение заключается в том, что праймеры, используемые для ПЦР, могут отжигать неспецифические последовательности, которые являются сходными, но не полностью идентичными ДНК-мишени.

Кроме того, неправильные нуклеотиды могут быть включены в последовательность ДНК-полимеразой, хотя и с очень низкой скоростью.

Резюме

ПЦР представляет собой простой и широко используемый метод, при котором мелкие количества ДНК могут быть амплифицированы в большое количество копий.

В дополнение к быстроте, с которой работает этот анализ, он способен количественно продемонстрировать, какая часть конкретной последовательности присутствует. Как и во всех методах, справедливость результатов следует сравнивать со спецификой, связанной с этим методом.

Будущее ПЦР является многообещающим, сочетая различные анализы и подходы для лучшего понимания различных комбинаций генов.

Например, в исследовании по связыванию отдельных таксонов в микробном сообществе с конкретными метаболическими процессами стабильное зондирование изотопов было объединено с qPCR. Эксперименты с микрочипом могут быть подтверждены подходом qPCR из-за его быстроты.

Источник: https://LabwareGuid.ru/2017/11/24/metod-pcr/

Полимеразная цепная реакция (ПЦР): что это за метод, как работает, компоненты реакции, применение ПЦР, преимущества

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

Наверное, каждый врач сталкивался в своей практике с такими случаями — никакой явновыраженной сиптоматики, микробиологические исследования — в пределах нормы, а у пациента температура две недели не падает, или простатит рецидивирующий, или еще какая-то болячка, с которой не удается справиться. А истинную причину выяснить ну никак не удается. Мистика? Непрофессионализм? Нет. Это недостатки диагностики. Иногда вирус или бактерия могут находиться в крови столь малых количествах, что чувствительность традиционных методов диагностики не позволяет их выявить.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

А они, тем временем, делают свое темное дело, нанося порою непоправимый вред организму. Но ситуация меняется. теперь на вооружении у врачей есть тонкий высокочувствительный метод диагностики — полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В настоящее время ПЦР является самым чувствительным и самым точным методом диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, который позволяет получить значительное увеличение количества определенных участков ДНК из биологических проб, в которых исходная ДНК содержится в сверхмалых количествах.

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами – расщепление или сращивание участков ДНК, введение мутаций. Поэтому метод ПЦР нашел свое практическое применение в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, определении отцовства , в клонировании и в генной инженерии.

Первые опыты по амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК, названных праймерами, проводил еще норвежский ученый Хьеллю Клеппе в 70-е годы прошлого столетия. Но его идея так и осталась нереализованной.

И только спустя почти десять лет, в 1983 году полимеразная цепная реакция была открыта американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНКполимеразы.

Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. А через восемь лет К.Муллис получил Нобелевскую премию за открытый им метод.

Что такое пцр

Каждый живой организм имеет определенный набор специфичных, присущих только ему участков ДНК. Метод ПЦР позволяет найти в исследуемом материале среди огромного количества генетической информации именно такие специфичные участки и многократно их размножить.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем расплетение двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплиментарное дополнение обеих. Репликация ДНК начинается только в определенных местах, где расположены стартовые блоки, а не в любой произвольной точке.

Читайте также:  Анализ на вич положительный - чем это грозит, что делать

Суть метода заключается в том, что маркировав стартовыми блоками специфичные участки ДНК, характерные только для данного вида, можно многократно воспроизвести (амплифицировать) именно этот участок ДНК. В результате нарабатывается достаточное количество генетического материала для последующей детекции.

Метод ПЦР настолько точен, что он позволяет не только выявлять наличие ДНК возбудителя в биологической пробе, но и точно установить его количество и генотипическую принадлежность.

Как работает пцр

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, с помощью ПЦР можно амплифицировать относительно короткие участки ДНК, длиной не более 3000 пар оснований. Используя смеси различных полимераз, специальных катализаторов и соблюдая особые условия, исследователям удавалось амплифицировать с помощью ПЦР фрагменты ДНК длиной 20-40 тыс. пар оснований. Но это все равно ничтожно мало в сравнении с длиной хромосомной ДНК эукариотической клетки. Геном человека, например, состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для того, что бы провести анализ методом ПЦР, необходимо иметь в наличии короткие одноцепочечные участки ДНК, специфичные для данного вида возбудителя, называемые «праймерами».

Но специфичного участка длиной в несколько тысяч оснований вполне достаточно, что бы дифференцировать тип возбудителя.

Для проведения ПЦР вначале исследуемый материал нагревают до температуры денатурации, добиваясь того, что бы двухцепочечные молекулы ДНК исходного материала разделились на одиночные нити. Затем вносят праймеры.

При внесении праймеров в раствор с исследуемым материалом, праймеры начинают «прочесывать» раствор в поисках участков, к которым они являются комплиментарными.

Если такие участки найдены – то праймеры присоединяются к ним, образовав стартовые двухниточные участки.

После присоединения праймера (этот процесс называют «отжиг») начинается синтез маркированного специфического участка ДНК с помощью специфического фермента – Taq-полимеразы, который получают из термофильных бактерий.

Вновь синтезированные фрагменты ДНК становятся матрицами для синтеза новых участков ДНК в последующих циклах амплификации. Поэтому такая реакция и называется цепной. В результате 25 циклов амплификации из одного участка ДНК синтезируется 106 копий.

А после 30-40 циклов нарабатывается достаточное количество ДНК, что бы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза в агарозном геле.

Компоненты реакции пцр

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

Подробнее…

Проведение анализа исследуемого материала методом ПЦР состоит из 3 этапов:

  • Подготовка материала для ПЦР путем разделения и изоляции ДНК и РНК
  • Собственно проведение полимеразной цепной реакции
  • Детекция продукта ПЦР

Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты:

  • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
  • Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
  • Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.

Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофильных бактерий – Thermus aquaticus (Taqполимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Может быть использовано высококипящее минеральное масло (например, вазелиновое). Но это зависит от амплификатора, в котором проводится реакция. Если это амплификатор с подогреваемой крышкой, исключающий испарение реакционного раствора, то масло в пробирку не добавляется.

Также необязательным компонентом является пирофосфатаза. Этот фермент катализирует гидролиз побочного продукта реакции – пирофосфата, который может ингибировать полимеразную цепную реакцию.

Применение пцр

ПЦР – диагностика универсальна. Для проведения анализа методом ПЦР используется любой биологический материал, в котором может содержаться ДНК возбудителя – слизи, моча, кровь, мокрота, соскобы и биоптаты.

широкое распространение получил метод ПЦР для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических. Это такие инфекции как хламидиоз, гарднереллез, микоплазменная инфекция и пр. Это возбудители, которых сложно выявить классическим способом выращивания клеток в лабораторных условиях. Да и анализ антител в серологическом растворе может быть неточным.

А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, секрет простаты или мочу, можно с точностью установить наличие именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.

Также метод ПЦР незаменим для диагностики вирусных заболеваний. Кроме выявления наличия вируса в пробе, ПЦР позволяет определять генотип вируса. Что очень важно, например, при выборе методов лечения папилломавируса человека и прогнозирования развития заболевания, т.к.

вирусы ВПЧ, принадлежащие к разным типам, обладают различной патогенностью и онкогенностю. Также генотипирование важно при диагностике вирусных гепатитов. Метод ПЦР используется для контроля за эффективностью лечения при вирусных гепатитах.

Для этого производится так называемый «количественный» анализ, который позволяет не только выявить наличие вирусной ДНК, но и с точностью определить количество вирусов, содержащихся в крови.

  • Не стоит забывать и о диагностике ВИЧ-инфекции.
  • Метод ПЦР нашел свое применение в пульмонологии, где он используется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии.
  • Метод может быть применен для выявления хеликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам – это только одна из возможностей ПЦРдиагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое.

Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему детской смертности и инвалидности, связанной с развитием у детей наследственных болезней, наследственной предрасположенности к некоторым видам смертельных недугов (например, к раку). Именно ПЦР является тем методом, который позволяет выявить поврежденные участки ДНК, связанные с точечными мутациями генов, и влекущие страшные последствия.

Несмотря на то, что ПЦРдиагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования и соблюдением ряда правил.

ПРЕИМУЩЕСТВА

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

Подробнее…

Метод ПЦР стал «золотым стандартом» при диагностике ряда заболеваний.

Главное преимущества метода – это его чувствительность. ПЦР позволяет выявить возбудителей в тех случаях, когда из за сверхмалого количества они недоступны для других методов.

Благодаря особенности ПЦР, позволяющей выявлять даже единичные экземпляры возбудителей в биологическом материале, метод особенно ценен в диагностике латентных и хронических форм заболеваний.

Возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов очень сложно обнаружить другими методами, а ПЦР дает такую возможность.

Также огромным достоинством метода является его быстрота, т.к весь процесс, начиная с выделения вирусной или бактериальной ДНК из пробы, занимает всего несколько часов.

В то время, как трудоемкий метод выращивания визуализируемых колоний возбудителя в лабораторных условиях может занимать несколько дней.

Практически полная автоматизация метода сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб.

  1. Метод эффективен при диагностике трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий.
  2. Также метод может быть использован для тестирования объектов внешней среды.
  3. Специфичность метода составляет 100%.

Метод используется не только в диагностике, но и в наблюдении за динамикой течения заболеваний, т.к. позволяет определять число копий возбудителя в пробе и, тем самым, контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения. Что позволяет своевременно оценить эффективность лечения и произвести необходимые корректировки.

Очень важно, что при проведении исследования методом ПЦР практически исключается возможность инфицирования персонала во время проведения анализа, т.к. исследуемый материал может быть дезинфицирован химически или термически в момент забора.

ПЦР диагностика - что это, задачи, принцип использования

С начала нового века в медицинской практике все большее применение находит метод исследования ПЦР (полимеразная цепная реакция), характеризующаяся высокой чувствительностью и специфичностью

Подробнее…

doclvs.ru

Внимание! информация на сайте не является медицинским диагнозом, или руководством к действию и предназначена только для ознакомления.

Источник: https://doclvs.ru/medpop8/pcr2.php

Пцр (полимеразная цепная реакция) как метод исследования в днк-диагностике

  • Диагностика инфекционных заболеваний

    ДНК-диагностика – новая область медицины, использующая молекулярно-генетические методы для ранней диагностики заболеваний, выявления предрасположенности к ним и профилактических рекомендаций.

    Развитие таких технологий амплификации ДНК как ПЦР, произвело буквально революцию в клинической вирусологии, позволив быстро, точно и достаточно просто определить наличие вирусов в образце, поскольку известны последовательности ДНК многих болезнетворных микроорганизмов.

    Можно создать два праймера ПЦР, соответствующих последовательности исследуемого патогена (например, вируса) и расположенных на известном расстоянии на ДНК.

    Если затем выполнить ПЦР с использованием этих праймеров и с помощью гель-электрофореза провести анализ полученных продуктов, то в случае принадлежности исследуемого образца тому же вирусу, мы получим фрагмент, длина которого соответствует взятой для сравнения последовательности ДНК.

    Высокая специфичность ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале появляется характерный только для данного вида возбудителя фрагмент ДНК.

    Выявляя единичные клетки бактерий или вирусов, ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

    В клинической практике метод ПЦР часто используется для выявления вирусных гепатитов, опасных для человека, таких как: А , В , С, «Проведение типирования вируса гепатита С» , Дельта , Е, G , TTV.

    Важную роль метод играет в диагностике заболеваний, передающихся половым путем (ЗППП). Этиологическим фактором являются вирусы, бактерии и простейшие.

    К таким заболеваниям можно отнести появление доброкачественных аногенитальных бородовок (кондилом) , вызываемых вирусом папилломы человека (ВПЧ). Такие бородавки обычно появляются на участках, травмированных во время полового контакта. Генотипы ВПЧ 6 и 11 обнаруживаются более чем в 90% случаев.

    Читайте также:  Sg в анализе мочи - норма и расшифровка

    Такие пациенты могут быть одновременно инфицированы и ВПЧ типа 16 и 18, которые являются источником субклинических поражений, сочетающихся с внутриэпителиальной неоплазией и аногенитальным раком.

    Имеются доказательства, что папилломавирусы, относящиеся к высокоонкогенным (папилломавирусы высокого онкогенного риска — 16,18, 31,33,35, 39,45, 51, 56, 58, 59, 68), являются этиологическим фактором возникновения рака шейки матки.

    К заболеваниям передающихся половым путем относятся также и гепатиты В и С. Высокой степени риска инфицирования подвержены гомосексуалисты, лица занятые в сфере оказания сексуальных услуг.

    К наиболее распространенным инфекция, передающихся половым путем и диагностируемых методом ПЦР, являются урогенитальные инфекции, вызываемые патогенным микроорганизмом как у мужчин, так и у женщин — Chlamydia trachomatis (хламидия трахоматис). Их диагностика особенно важна для установления диагноза и лечения у лиц с бессимптомным течением.

    Выявление хламидий трахоматис важно также для установления этиологического фактора, вызвавшего у мужчин орхоэпидидимит (в таких случаях одновременно следует проводить и диагностику методом ПЦР на выявлении гонореи –Neisseria gonorrhoeae).

    Обнаружение хламидий является важным моментом для диагностики воспалительных заболеваний малого таза у женщин: сальпингита (воспаление маточных труб), эндометрита, параметрита, оофорита (воспаление яичников), тазового перитонита.

    Другим распространенным инфекционным агентом является бактерия, относящаяся к виду микоплазм — уреаплазма, как правило, передающаяся половым путем (Ureaplasma urealyticum) и ее клинически значимые биовары Parvum/T960, вызывающие воспалительные заболевания органов мочевыделительного тракта и их осложнения: простатит, бактериальный вагиноз, бесплодие.

    Применения метода ПЦР оправдано для выявления этиологического фактора уретрита. При гонококковом уретрите методом ПЦР выявляют Neisseria gonorrhoeae.

    Причиной негонококковых уретритов чаще бывают — Chlamydia trachomatis (в 30-50% случаев), Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma genetalium (возможно 10-20% случаев).

    К другим факторам негонококковых уретритов можно отнести Trichomonas vaginalis(до 17% случаев) — жгутиковое постейшее, передающееся у взрослых практически только половым путем , а также грибки рода Candida albicans (кандида), вызывающие вульвовагинальный кандидоз.

    Хотя бактериальный вагиноз (при синдроме влагалищных выделений) не относится к заболеваниям передающимся половым путем, методом ПЦР диагностики при этом заболевании можно выявить таких микроорганизмов как, Gardnerella vaginalis, Mycoplasma hominis, Mobiluncus, избыточная концентрация которых приводит к замещению молочнокислых бактерий влагалища и увеличению рН среды.

    К числу распространенных заболеваний, передаваемых половым путем, относятся заболевания вызываемые вирусом герпеса 2 типа (ВПГ-2 — генитальный герпес), который в классических случаях проявляется появлением типичных папулезных высыпаний, переходящих в пузырьки и изъявления, а также местным лимфаденитом. Следует учитывать, что и вирус простого герпеса 1 (ВПГ- 1) также выявляется при поражении гениталий. Герпес ВПГ 1 является причиной, так называемого орально-лабиального герпеса, и вызывает герпес слизистых, кожи, герпетические энцефалиты, офтальмогерпес.

    Инфицирование любым из этих двух вирусов приводит к развитию сходного первичного заболевания. Но частота рецидивов заболевания выше при инфицировании герпесом второго типа. Клинические признаки заболевания у пациентов существенно различаются.

    Инфицирование герпесом может протекать, например, в виде дерматозов или других генитальных инфекций.

    Поэтому лабораторная диагностика, и в частности ПЦР-метод, является важным приемом в установлении этиологического фактора болезни и назначении соответствующего лечения.

    К другим герпес-вирусам, тропным для человека и выявляемым при помощи ПЦР, относится вирус герпеса 3 типа – вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай.

    Вирус герпеса 4 типа – вирус Эпштейн-Барр является причиной инфекционного мононуклеоза, а также ассоциируется с лимфомой Беркита и назофарингеальной карциномой.

    Вирус герпеса 5 типа – вирус цитомегалии (ЦМВ), является причиной поражения печени, центральной нервной системы, возникновением интерстициальной пневмонии и нефритов, опасен для плода в ранние сроки заражения матери при беременности (выкидыши, мертворождения, рождения с пороками органов и систем). Вирус герпеса 6 и 7 типов (лимфотропные вирусы) относятся к вирусам, ассоциированным с синдромом хронической усталости. Вирус герпеса 8 типа – этиологический фактор саркомы Капоши (часто ассоциируемой с ВИЧ инфекцией).

    С появлением ПЦР стало возможным количественное определение вирусной нагрузки (уровня виремии), что особенно важно при острых и персистирующих инфекциях, так как просто детекция вируса не дает всей необходимой информации о течении болезни. К тому же определение вирусной нагрузки позволяет следить за лечением и возникновением резистентности к терапевтическим средствам.

    Самое широкое распространение методы ПЦР получили в диагностике таких инфекционных заболеваний, как СПИД (вызываемого ретровирусом ВИЧ), клещевой энцефалит, туберкулез, токсоплазмоз, листериоз, краснуха, вирус, вызывающий инфекционную эритему (парвовирус В19),. гемолитический стрептококк, хеликобактер пилори (Helicobacter pylori – этиологический фактор возникновения язвы желудка).

    ПЦР диагностике подлежат такие вирусы как: аденовирус, риновирус, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирус, метапневмовирус, вирус парагриппа, вызывающие поражение дыхательных путей и заболевания протекающие у детей часто в виде энтеритов (клиника дизентерии – боли в животе, поносы).

    При поражении дыхательных путей (пневмонии) метод ПЦР часто используется для идентификации этиологически значимых микроорганизмов в мазках из зева: Chlamydia pneumonia , Mycoplasma pneumonia , Streptococcus pneumonia (при подозрении на стрептококковую пневмонию).

    У детей использование ПЦР метода, наряду с бактериологическими и серологическими методами диагностики, позволяет установить или опровергнуть диагноз коклюша и обнаружить токсигенные штаммы дифтерии ( Corynebacterium diphtheriae ).

    Очень важно, что часто, нет необходимости дожидаться симптомов болезни. Например, видимые симптомы СПИДа проявляются иногда спустя несколько лет после заражения вирусом. Тем не менее, можно провести анализ ДНК в образцах крови, используя праймеры ПЦР, соответствующие последовательностям, которые присутствуют только в геноме ВИЧ.

    Особую ценность для диагностики ВИЧ-инфекции ПЦР имеет на двух этапах: в самом начале, когда инфицирование уже произошло, а антитела еще не успели образоваться, и на поздних стадиях заболевания, когда количество антител может снижаться вплоть до полного исчезновения.

    К тому же количественное определение РНК ВИЧ позволяет оценить варианты противовирусной терапии и осуществить индивидуальный подбор противовирусных препаратов.

    ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам. Примером этому является туберкулез.

    В отличие от многих бактерий, микобактерия, вызывающая это заболевание, растет очень медленно.

    Ее культивирование для выполнения классических диагностических испытаний может занять примерно месяц, в то время как идентификация микобактериальной ДНК с помощью ПЦР может быть выполнена в течение одного дня.

    Метод ПЦР эффективен как в отношении внутриклеточных паразитов, выявленных как в клиническом материале, полученном от больного, так и в образцах воды, почвы и т.д.

     

  • Источник: https://www.smed.ru/guides/67526/

    Полимеразная цепная реакция • Задачи

    Итак, при ПЦР размножается только участок, ограниченный праймерами. Сразу понятно, как получить множество копий нужного гена для генно-инженерных целей: надо просто подобрать такие праймеры, которые будут ограничивать нужный участок. Праймеры эти должны быть уникальны и не повторяться больше нигде в геноме.

    В принципе, та же задача стоит при выяснении наличия данного гена у данного вида живых существ. Если гена нет, ДНК размножаться не будет. Было ли размножение или его не было, можно будет понять, добавив к ПЦР-смеси краску, которая будет светиться при связывании с ДНК.

    Таким же образом выясняется наличие или отсутствие инфекционного заболевания. Подбираются праймеры под какой-нибудь уникальный ген возбудителя, и если этот ген размножился в образце, значит возбудитель в нем присутствовал.

    Прекрасно, но как же тогда определить мутацию в гене? Ведь сам ген будет присутствовать в геноме в любом случае — мутантный или нет.

    Решение этой проблемы очень изящно и отличается для снипов и инсерций-делеций. Начнем со снипов.

    Снип — это изменение в один нуклеотид. Чтобы понять, есть оно в данном гене или нет, мы подберем праймеры так, чтобы снип был внутри праймера. В результате если снип есть, то кусок ДНК будет размножаться, а если нет — то и нет.

    Хорошо, но как тогда разобраться с крупными изменениями ДНК — инсерциями и делециями? Бывает ведь, что при мутации выпадают или вклиниваются повторяющиеся участки ДНК — то есть в нормальном гене, допустим 4 повтора данного участка, а в мутантном — 2 или, наоборот, 7. Как в этом случае подобрать праймер — ведь участки будут идентичны?

    В этом случае мы подберем праймеры, которые будут окружать интересный нам участок с двух сторон. И когда этот участок размножится, мы прогоним продукты ПЦР на электрофорезе — эта методика позволяет разделить фрагменты ДНК по размеру. Короткий участок будет означать наличие делеции (или, наоборот, отсутствие инсерции), а длинный — отсутствие делеции (или, наоборот, наличие инсерции).

    И наконец — родственники и преступники. Родственные связи и корни преступных событий с помощью ПЦР выясняются очень похожим способом. Дело в том, что в ДНК каждого человека есть особые повторяющиеся участки — микросателлиты.

    Однако у каждого человека эти микросателлиты разбросаны в своих участках генома; сходство в их распределении тем больше, чем ближе родственные связи между обладателями исследуемой ДНК.

    Если мы поставим ПЦР с праймерами на этих участках, то в результате получим уникальное распределение длин получившихся отрезков ДНК — генетический отпечаток пальца. У родственников такие «отпечатки пальцев» будут тем более похожи, чем ближе родство.

    Если же нам повезет обнаружить на месте преступления ДНК преступника, то нам достаточно будет сравнить его «отпечаток пальца» с «отпечатками пальцев» подозреваемых.

    Источник: https://elementy.ru/problems/1097/Polimeraznaya_tsepnaya_reaktsiya

    Пцр (полимеразная цепная реакция). как производится пцр диагностика, показания, как подготовиться к исследованию, результат пцр :: polismed.com

    Сайт предоставляет справочную информацию. Адекватная диагностика и лечение болезни возможны под наблюдением добросовестного врача. У любых препаратов есть противопоказания.

    Читайте также:  Биопсия опухоли - что это, для чего, что показывает

    Необходима консультация специалиста, а также подробное изучение инструкции! Для адекватного и эффективного лечения многих инфекционных заболеваний необходимо своевременное установление точного диагноза. В решении этой задачи в наши дни привлекаются высокотехнологичные методы диагностики основанные на методах молекулярной биологии.

    В настоящий момент  полимеразная цепная реакция (ПЦР) уже достаточно широко применяется в практической медицине как наиболее надежный инструмент лабораторной диагностики. Во-первых, данный метод используется для выявления возбудителей различных инфекционных заболеваний с высокой точностью. Во-вторых, для контроля эффективности проведенного лечения.

    В различных руководствах, проспектах, статьях, а также объяснениях врачей-специалистов, мы часто сталкиваемся с употреблением непонятных терминов и слов. Действительно трудно рассказать о высокотехнологичных продуктах науки обыденными словами.

    Каждый живой организм имеет свои уникальные гены. Гены располагаются в молекуле ДНК, которая собственно и является «визитной карточкой» каждого конкретного организма. ДНК (генетический материал) – это очень длинная молекула, которая состоит из «кирпичиков», называемых нуклеотидами. У каждого возбудителя инфекционных заболеваний они расположены строго специфично, то есть в определенной последовательности и комбинации. Когда необходимо понять имеется ли у человека тот или иной возбудитель, забирается биологический материал (кровь, моча, слюна, мазок), который содержит ДНК или фрагменты ДНК микроба. Но количество генетического материала возбудителя очень мало, и невозможно сказать какому именно микроорганизму он принадлежат. Для решения этой задачи и служит ПЦР. Суть полимеразной цепной реакции заключается в том, что берется малое количество материала для исследования, содержащего ДНК, а в процессе ПЦР происходит увеличение количества генетического материала, принадлежащего конкретному возбудителю и, таким образом, его можно идентифицировать. Идея метода ПЦР принадлежит американскому ученому K.Mullins, которую он предложил в 1983 году. Однако широкое клиническое применение получила лишь в средине 90-х годов XXвека. Разберемся с терминологией, что же это такое – ДНК и т.д. Каждая клетка любого живого существа (животного, растения, человека, бактерии, вируса) имеет хромосомы. Хромосомы – это хранители генетической информации, которые содержат всю последовательность генов каждого конкретного живого существа. Каждая хромосома состоит из двух нитей ДНК, закрученных в спираль друг относительно друга. ДНК – химически это дезоксирибонуклеиновая кислота, которая состоит из структурных компонентов – нуклеотидов. Нуклеотидов бывает 5 видов – тимин (Т), аденозин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц) и урацил (У). Нуклеотиды располагаются друг за другом в строгой индивидуальной последовательности, образуя гены. Один ген может состоять из 20-200 таких нуклеотидов. Например, ген, кодирующий выработку инсулина, состоит из 60 пар нуклеотидов. Нуклеотиды имеют свойство комплементарности. Это означает что напротив аденина (А) в одной цепочке ДНК обязательно стоит тимин (Т) в другой цепочке, а напротив гуанина (Г) – цитозин (Ц). Схематически выглядит следующим образом:

    • Г — Ц Т — А
    • А — Т

    Данное свойство комплементарности ключевое для проведения ПЦР.

             Молекулы ДНК и РНК могут «размножаться» (данное свойство используется для проведения ПЦР). Происходит это следующим образом: две нити ДНК или РНК, отходят друг от друга в стороны, на каждую нить садится специальный фермент, который синтезирует новую цепочку.

    Синтез идет по принципу комплементарности, то есть, если в исходной цепочке ДНК стоит нуклеотид А, то во вновь синтезированной будет стоять Т, если Г – то Ц и т.д. Этот специальный фермент-«строитель» для начала синтеза нуждается в «затравке» — последовательности из 5-15 нуклеотидов.

    Данная «затравка» определена для каждого гена (гена хламидии, микоплазмы, вирусов) экспериментально.

    Итак, каждый цикл ПЦР состоит из трех стадий. В первую стадию происходит так называемое раскручивание ДНК – то есть разделение связанных между собой двух цепей ДНК. Во вторую — происходит присоединение «затравки» к участку нити ДНК.

    И, наконец, удлинение данных нитей ДНК, которое производится ферментом-«строителем».

    В настоящее время весь этот сложный процесс протекает в одной пробирке и состоит из повторяющихся циклов размножения определяемой ДНК с целью получения большого количества копий, которые могут быть, затем выявлены обычными методами. То есть из одной нити ДНК мы получаем сотни или тысячи.

    В качестве пробы служит различный биологический материал: кровь и ее компоненты, моча, слюна, отделяемое слизистых оболочек, спинномозговая жидкость, отделяемое раневых поверхностей, содержимое полостей тела. Все биопробы собираются одноразовыми инструментами, а набранный материал заключают в пластиковые стерильные пробирки или помещают на культуральные среды, с последующей транспортировкой в лабораторию. В забранные пробы добавляют необходимые реагенты и ставят в программируемый термостат – термоциклер (амплификатор). В амплификаторе 30-50 раз повторяется цикл ПЦР, состоящий из трех этапов (денатурация, отжиг и удлинение). Что это означает? Рассмотрим подробнее. I этап ПЦР — Подготовка генетического материала для копирования. Происходит при температуре 95° С, при этом нити ДНК разъединяются, и на них могут садиться «затравки». «Затравки» изготавливают промышленным способом различные научно-производственные объединения, а лаборатории покупают уже готовые. При этом «затравка» для выявления, например, хламидии, работает только для хламидии и т.д. Таким образом, если тестируется биоматериал на наличие хламидийной инфекции, то в реакционную смесь помещается «затравка» для хламидий; если тестирование биоматериала на вирус Эпштейн-Барра, то и «затравка» для вируса Эпштейн-Барра.

    II этап – Объединение генетического материала возбудителя инфекции и «затравки».

    Если имеется ДНК определяемого вируса или бактерии, «затравка» садится на эту ДНК. Этот процесс присоединения «затравки» и есть второй этап ПЦР. Данная стадия проходит при температуре 75°С.

    III этап — Копирование генетического материала возбудителя инфекции.

     Это процесс собственно удлинения или размножения генетического материала, который происходит при 72°С. К «затравкам» подходит фермент- «строитель» и синтезирует новую цепочку ДНК. С окончанием синтеза новой цепочки ДНК, заканчивается и цикл ПЦР. То есть за один цикл ПЦР происходит увеличение количества генетического материала в два раза. Например, в исходной пробе имелось 100 молекул ДНК какого-либо вируса, после первого цикла ПЦР в пробе будет уже 200 молекул ДНК тестируемого вируса. Один цикл длится 2-3 минуты.

     Для образования достаточного количества генетического материала для идентификации, обычно производится 30-50 циклов ПЦР, что занимает 2-3 часа.

    Собственно ПЦР на этом заканчивается и далее идет не менее значимый этап идентификации. Для идентификации используют метод электрофореза или меченые «затравки». При использовании электрофореза полученные нити ДНК разделяются по размерам, и наличие фрагментов ДНК разной длины свидетельствует о положительном результате анализа (то есть о наличии того или иного вируса, бактерии и т.д.). При использовании меченых «затравок», к конечному продукту реакции добавляют хромоген (краситель), вследствие чего ферментативная реакция сопровождается образованием окраски. Развитие окраски прямо свидетельствует, что вирус или другой выявляемый агент присутствуют в исходной пробе.

    На сегодняшний день, используя меченые «затравки», а также соответствующее программное обеспечение, можно производить сразу и «чтение» результатов ПЦР. Это так называемаяreal-time ПЦР.

    Одним из существенных преимуществ метода ПЦР является высокая чувствительность – от 95 до 100%. Однако, эти преимущества должны базироваться на непременном соблюдении следующих условий:

    1. корректный забор, транспортировка биологического материала;
    2. наличие стерильного, одноразового инструментария, специальных лабораторий и обученного персонала;
    3. строгое соблюдение методики и стерильности во время проведения анализа

    Чувствительность различается для различных выявляемых микробов. Так, например, чувствительность метода ПЦР для выявления вируса гепатита С составляет 97-98%, чувствительность для выявления уреаплазмы – 99-100%. Возможности, заложенные в ПЦР-анализе, позволяют достичь непревзойденной аналитической специфичности. Это означает выявление именно того микроорганизма, который искали, а не похожего или близкородственного. Диагностическая чувствительность и специфичность метода ПЦР, зачастую превосходят таковые и для культурального метода, называемого «золотым стандартом» для выявления инфекционных заболеваний. Учитывая продолжительность выращивания культуры (от нескольких дней до нескольких недель), преимущество метода ПЦР становится очевидным.  

    ПЦР в диагностике инфекций

    Преимущества метода ПЦР (чувствительность и специфичность) определяют широкий спектр применения в современной медицине. Основные области применения ПЦР-диагностики:

    1. диагностика острых и хронических инфекционных заболеваний различной локализации
    2. контроль эффективности проведенной терапии
    3. уточнение вида возбудителя

    ПЦР используется в акушерстве, гинекологии, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, клинике инфекционных болезней, офтальмологии, неврологии, фтизиопульмонологии и др. Использование ПЦР-диагностики производится в совокупности с другими методами исследования (ИФА, ПИФ, РИФ и др.). Их сочетание и целесообразность определяет лечащий врач.

    Возбудители инфекций, обнаруживаемые методом ПЦР

    Вирусы:

    1. ретровирусы HIV-1 и HIV-2
    2. герпетиформные вирусы
    3. вирус простого герпеса 1 и 2 типов
    4. цитомегаловирус
    5. вирус Эпштейна-Барр
    6. варицелла – Зостер вирус
    7. герпес вирусы человека 6 и 7
    8. вирус гепатита С, В и А
    9. вирусы папилломы человека
    10. вирус краснухи
    11. аденовирусы
    12. риновирусы
    13. парвовирусы
    14. пикорновирусы

      Бактерии:

    1. микобактерии
    2. хламидии
    3. микоплазмы
    4. сальмонелла
    5. легионеллы
    6. клостридии
    7. бледная трепонема
    8. различные патогенные виды кишечной палочки
    9. холерный вибрион
    10. риккетсии
    11. золотистый стафилококк
    12.  бактериальный возбудитель менингита
    13. хеликобактер пилори
    14. уреаплазма
    15. возбудитель гонореи
    16. дифтерийная палочка
    17. гемофильная палочка

      В данном списке приведены наиболее распространенные инфекционные агенты, выявляемые методом ПЦР. На самом деле данный список гораздо шире, постоянно пополняется, так как синтезируются новые «затравки». Также следуют отметить, что список определяемых возбудителей определяется наличием «затравок» для идентификации в арсенале каждой конкретной лаборатории.

    Наседкина А.К.  

    Специальность: Врач офтальмолог

    Источник: https://www.polismed.com/articles-pcr-polimeraznaja-cepnaja-reakcija-kak-proizvoditsja-pcr-diagnostika-pokazanija-kak-podgotovit-sja-k-issledovaniju-rezul-tat-pcr.html

    Ссылка на основную публикацию
    Adblock
    detector